熒光是物質(zhì)吸收給定波長的光并發(fā)射另一波長的光時發(fā)生的現(xiàn)象。熒光發(fā)生于電子，該電子被激發(fā)到更高且更不穩(wěn)定的能量狀態(tài)，弛豫到其基態(tài)并發(fā)出光子。負責(zé)激發(fā)或?qū)㈦娮右苿拥礁吣芰繝顟B(tài)的光，其波長和能量要比熒光發(fā)射的波長和能量長，而熒光發(fā)射的波長更長，能量更低且顏色不同。

熒光顯微鏡結(jié)合了光學(xué)顯微鏡的放大特性和熒光技術(shù)，該技術(shù)可以激發(fā)和檢測熒光團-熒光化合物的發(fā)射。借助熒光顯微鏡，科學(xué)家可以觀察組織內(nèi)特定細胞類型或細胞內(nèi)分子的位置。

熒光顯微鏡的原理和組成

熒光顯微鏡的原理很簡單。當(dāng)光離開弧光燈時，它被引導(dǎo)通過一個勵磁濾波器，該濾波器選擇激發(fā)波長。

該光被稱為二向色鏡的特殊鏡向樣品反射，該鏡被設(shè)計為僅反射激發(fā)波長的光。反射光穿過物鏡，然后將其聚焦到熒光樣本上。樣品發(fā)出的光又依次通過物鏡-發(fā)生圖像放大的物鏡-現(xiàn)在通過二向色鏡。

該光被屏障過濾器過濾，屏障過濾器選擇發(fā)射波長并過濾掉來自弧光燈或其他從顯微鏡組件反射回來的光源的污染光。zui終，過濾后的熒光發(fā)射被發(fā)送到檢測器，在此圖像可以被數(shù)字化，或者被傳輸?shù)侥跨R進行光學(xué)觀察。

激發(fā)濾光片，二向色鏡和屏障濾光片可以組裝在一起，成為一個稱為濾光片立方的組件。觀察樣品期間可以改變不同的濾光片立方體以改變激發(fā)波長，并且可以使用一系列的隔膜來改變激發(fā)強度。

在進行熒光顯微鏡檢查時，熒光團與顯微鏡本身一樣重要，并且要成像的熒光團的類型決定了所用的激發(fā)波長和所檢測到的發(fā)射波長。激發(fā)波長包含能被熒光團吸收并使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)的小范圍能量。激發(fā)后，可能會產(chǎn)生大范圍的發(fā)射或轉(zhuǎn)換回較低的能量狀態(tài)，從而產(chǎn)生發(fā)射光譜。

吸收或激發(fā)曲線的峰值與發(fā)射曲線的峰值之間的差稱為斯托克頻移。該偏移的距離越大，則將兩個不同的波長分開就越容易。此外，濾鏡立方體的組件需要去除任何重疊的光譜，以減少背景并提高圖像質(zhì)量。

熒光團長時間處于激發(fā)狀態(tài)會導(dǎo)致其發(fā)生光漂白，這是熒光減弱或丟失的原因。為了減少光漂白，您可以在幻燈片上添加防褪色安裝介質(zhì)，并用指甲油密封邊緣?；脽羝诓怀上駮r也應(yīng)保持在黑暗中。

熒光顯微鏡成像