如前所述，光學顯微鏡通過使用玻璃透鏡來可視化圖像，而放大倍率則取決于透鏡將光彎曲并將其聚焦在形成圖像的樣本上的能力。當光線穿過一種介質進入另一種介質時，該射線在界面處彎曲，從而引起折射。 光的彎曲由折射率決定，折射率是衡量物質減慢光速的程度。光的彎曲方向和大小取決于形成界面的兩種介質的折射率。

折射率較低的介質（例如，玻璃對空氣）通常會加快光的穿透速度，并使光線偏離法線，并且當光線穿過折射率較大的介質（例如，對玻璃與空氣）時，通常會減慢光速向下并垂直于表面朝向法線彎曲。

如果將物體放在這兩種介質之間（即在水和空氣之間）（在這種情況下為棱鏡），則棱鏡會將光線彎曲一定角度。顯微透鏡就是這樣工作的，它們將光線彎曲一個角度。透鏡（凸面）在接收光線時，將光線聚焦在稱為焦點（F點）的特定點上。距鏡頭中心和焦點的距離的度量稱為焦距。

顯微鏡使用預定強度的透鏡，因為透鏡的強度與焦距直接相關，即，短焦距比長焦距的透鏡放大的物體更多。

顯微鏡的工作嚴格地取決于分辨率，其中分辨率是鏡頭能夠分辨緊密堆積在一起的小物體的能力。光學顯微鏡的分辨率取決于其透鏡系統的數值孔徑和所采用的光的波長。數值孔徑，定義了照射樣品時產生的光波長。

然后可以通過阿貝方程使用照亮樣本的光的波長（Lambda，λ）和數值通過阿貝方程來計算兩個物體之間的zui小距離（d），該zui小距離（d）可以區分為兩個獨立的實體，由光的波長確定孔徑（NA，n sin?）即d = 0.5λ/ n sin?